METODE PEMERIKSAAN UNTUK MENENTUKAN JENIS-JENIS BAKTERI

A. Mengamati Morfologi Koloni Bakteri
Kegiatan ini merupakan tindakan pertama kali jika ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya.
Cara Kerja :
Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran.
Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang tegak lurus.
Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stab inoculation.
Tumbuhkan biakan pada media NB.
Pertumbuhan pada Cawan Petri
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
Ukuran:
Gambar disamping menunjukan ukuran :
- pinpoint/punctiform (titik)
- Small (kecil)
- Moderate (sedang)
- Large (besar)

Pigmentasi mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media. Karakteristik optik dapat diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian), Transparant (bening).

Bentuk :
Circular
Irregular
Spindle
Filamentous
Rhizoid
Gambar disamping menunjukan Bentuk
Elevasi :
Flat
Raised
Convex
Umbonate
Gambar disamping menunjukkan Elevasi

Permukaan :
Halus mengkilap
Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
Margins :
Entire
Lobate
Undulate
Serrate
Felamentous
Curled

B. Pertumbuhan pada Agar Miring
Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus
Ciri koloni berdasarkan bentuk:
C. Pertumbuhan pada Agar Tegak
Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.
Ciri-ciri koloni berdasar bentuk :

Ciri koloni berdasar kebutuhan O2 :

D. Pertumbuhan pada Media Cair
Pola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2

E. Mengamati Morfologi Bakteri
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan z`at warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Macam-macam pewarnaan bakteri :
Pewarnaan sederhana, meliputi :
pewarnaan positif
pewarnaan negatif
Pewarnaan diferensial
pewarnaan gram
pewarnaan acid fast dll.
Pewarnaan khusus
pewarnaan endospora
pewarnaan flagella dll.

Pewarnaan Ziehl Neelsen
Pewarnaan Neisser
Pewarnaan Fluoresensi
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalnya biru metilen, karbol fuchin atau violet
Pewarnaan Positif
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
Bersihkan object glass dengan kapas
Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata.
Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali)
Setelah benar-benar kering dan tersebar selanjutnya ditetesi dengan pewarna (dapat digunakan Methylen blue, Safranin, Crystal Violet) dan tunggu kurang lebih 30 detik.
Cuci dengan akuades kemudian keringkan dengan kertas tissue
Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10).

Pewarnaan Negatif
Suspensi kuman dibuat dalam zat warna negrosin/tinta bak dan disebar ratakan dengan gelas. Disini kuman tidak diwarna dan tampak sebagai benda terang dengan latar belakang hitam. Pewarnaan ini digunakan untuk kuman yang sukar diwarnai, misalnya treponema, leptospira dan borrelia
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam.
Cara kerja:
Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass
Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan
Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri
Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atau api,Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri

Pewarnaan diferensial
Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.
Berikut merupakan tabel prosedur pewarnaan Gram:

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sbb:
Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan khusus
Pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai bagian-bagian sel kuman tertentu yang sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa. Misalnya untuk mengamati flagel digunakan pewarnaan Gray, untuk mengamati simpai (kapsul) dengan pewarnaan Muir, pewarnaan Hiss dan pewarnaan Gins Burri, suatu kombinasi pewarnaan negative dengan pewarnaan sederhana (karbol fushin). Simpai tidak diwarna dan terlihat sebagai bulatan-bulatan terang dengan latar belakang gelap, sedangkan badan kuman berwarna merah. Untuk melihat spora dengan pewarnaan klein spora berwarna merah dan badan kuman berwarna biru.
Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton.


Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya

Pewarnaan Ziehl Neelsen
Setelah sediaan difiksasi, diwarnai dengan carbon funchsin selama 5 menit, sambil dipanaskan dengan api menyala hingga ke luar Uap, tetapi jangan sampai mendidih.
Sediaan dicelupkan ke dalam larutan H_2 〖SO〗_(4 )5 % selama 1-2 detik.
Dicuci dengan alcohol 95% sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur.
Dicuci dengan air untuk menghilangkan alcohol.
Diwarnai dengan methyelen blue selama 3 menit.
Dicuci dengan air.
Dikeringkan kemudian dilihat dengan mikroskop.
Dengan pewarnaan Ziehl neelsen, bakteri dibagi dalam 2 golongan, yaitu :
Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tahan asam ( acid past)
Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tidak tahan asam (non–acid fast).
Contoh bakteri tahan asam : mycobacterium tuberculosis, mycobacterium leprae. Semua bakteri gram negatiif tidak tahan asam, sedangkan bakteri gram positif ada tahan asam, ada yang tidak tahan asam. Sifat tahan asam attaupun tidak tahan asam ini, adalah tetap dan turun- temurun.
F. Mengamati motilitas
1. Pengamatan Langsung
Cara Kerja :
Teteskan biakan bakteri motil seperti Bacillus atau E.coli ke object glass (sebaiknya dari biakan cair). Jika digunakan biakan padat maka ulas dengan jarum inokulum lalu ditambah akuades satu tetes, ratakan.
Tutup dengan cover glass
Amati menggunakan mikroskop dengan perbesaran maksimak. Bakteri akan tampak transparan dan pola pergerakannya tidak beraturan. Hati-hati jangan salah membedakan antara sel yang bergerak sendiri karena flagel atau bergerak terkena aliran air.
Pengamatan tidak langsung
Cara Kerja :
Tanam biakan pada media NA tegak atau Media Motilitas dengan cara tusuk (Stab inoculation) sedalam + 5 mm.
Inkubasi pada suhu 370 C selama 1x 24 jam
Hasil positif (motil) jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media, hasil negatif menunjukan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja

Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan
G. Cara melihat gerak gerak bakteri
Cara mikroskopis ( tetes gantung)
Pada cover-glass ( gelas penutup) diteteskan 1 tetes suspensi bakteri dan diletakan pada cekungan object glass cekung, sehingga tetesan suspense bakteri itu letaknya menggantung. Antara cover glass dengan object glass diberi vaselin agar tidak bergeser dan airnya tidak mengguap. Kemudian dilihat dengan mikroskop.
Gambar 122
Cara makroskopis ( cara craig)
Cara ini pertama kali dikerjakan oleh craig, yaitu dengan menggunakan perbenihan semi solid ( setengah padat). Untuk hal ini dipergunakan perbenihan cair yang diberi agar-agar ± 1/4 % ( satu perempat persen)n dan diletakkan secara tegak didalam tabung reaksi.
Pemeriksaan dilakukan dengan cara menanamkan bakteri dengan menggunakan jarum yang ditusukkan kedalam perbenihan semisolid secara tegak, setelah terlebbih dahulu jarum tersebut dicelupkan kedalam suspensi bakteri yang akan diperiksa. Kemudian, dieramkan selama 24 jam dalam inkubator. Pada garis tanam ( tempat penusukan) bakteri akan berkembang biak karena adanya zat makanan dai perbenihan, esok harinya dilihat.
ada 3 kemungkinan :
Pada bakteri yang tidak bergerak multiplikasi atau perbanyakan bakteri hanya terjadi pada tempat dimana bakteri ditanamkan, sehingga akan terlihat garis tanam menebal, yang berarti bahwa bakteri setelah berkembang biak tetap ditempatnya karena tidak dapat bergerak.
Pada bakteri yang dapat bergerak yang bersifat aerob, akan terlihat garis tanam melebar kearah permukaan perbenihan, yang berarti bahwa bakteri setelah membelah diri bergerak ketempat dimana banyak makanan dan oksigen.
Pada bakteri yang dapat bergerak dan bersifat anaerob, akan terlihat garis tanam melebar kearah dasar perbenihan, yang berarti bahwa bakteri setelah berkembang biak, bergerak ke tempat dimana terdapat banyak makanan dan mengandung oksigen.
Isolasi dan Identifikasi
Isolasi dan identifikasi dilakukan guna menemukan spesies suatu mikroorganisme (bakteri) sebagai penyebab infeksi. Sampel yang dapat dilakukan penanaman pada media biakan untuk diisolasi, yang tidak menutup kemungkinan dari suatu sampel dapat ditemukan lebih dari satu bakteri. Penanaman pada media biakan berguna juga melihat ciri-ciri pertumbuhan suatu bakteri pada media sehinnga dapat untuk mengidentifikasi / menentukan cirri-ciri spesies bakteri dari sampel yang diperiksa.

Pemeriksaan Biokimia
Pemeriksaan biokimia dilakukan dengan melakukan penanaman sampel atau hasil biakan kedalam median biokimia reaksi. Dari hasil pembiakan bakteri akan menunjukan sifat-sifat pertumbuhan dalam media tersebut misalnya ditandai adanya pembentukan gas, H2S, perubahan pada media asam atau basa. Sifat-sifat pertumbuhan ini bermanfaat untuk menentukan cirri-ciri dari suatu bakteri sehingga dapat untuk menentukan bakteri penyebab infeksi pada suatu sampel
Pewarnaan Neisser
Pewarnaan neisser, khusus untuk mewarnai corynebaacterium diphtheria. Untuk pewarnaan ini digunakan 3 macam zat warna, yaitu :
Neisser A isinya methylen blue
Neisser B isinya gentian violet
Neisser C isinya chrysoidin (berwarna kuning)
Setelah dilakukan fiksasi, sediaan diwarnai dengan campuran 2 bagian neisser A dan 1 bagian dengan bagian neisser B( campuran ini harus selalu dibuat baru) selama 15-30 detik. Kelebihan zat warna dibuang dan tanpa dicuci sediaan diwarnai dengan neisser C selama 15-30 detik. Tanpa dicuci sediaan dikeringkan diantara 2 helai kertas saring. Kemudian dilihat dengan mikrosop.
Akan terlihat corynebacterium diptheriae berbentuk seperti halter, di mana batangnya berwarna tengguli ( kecoklat- coklatan) sedangkan kedua benjolan inni diduga sebagai makanan persediaan dan disebut grandula babes Ernest.

Pewarnaan Fluoresensi
Objek yang akan dilihat diwarnai dengan zat warna yang dapat berflouoresensi yang disebut fluochrhome, misalnya flourenscein isothiocyanate (FITC). Dengan teknik tertentu flochrome dipakai nuntuk mewarnai antibody sehingga dapat dipakai untuk diagnose penyakit berdasarkann ditemukan antibody.